该书针对《内经》中深奥的中医学理论，归纳为81个问题，进行释疑解难。内容包括脉诊、脏腑、阴阳、五行、病能、营卫、俞穴、针灸、以及三焦、命门、奇经八脉等理论疑难问题。涉及到人体正常生理、解剖、疾病、证候、诊断、针灸与治疗，以及阴阳五行学说等种种疑难问题的论述。内容十分丰富，在阐发中医学基本理论方面占有重要的地位。

　　全书共3卷（一说5卷），分81难。

　　1～22难，主要论述脉学，介绍脉诊的基本知识、脉学的基础理论，以及正常与反常脉象。首先提出了独取寸口的诊脉法，把古代比较繁难的三部九候等各种诊脉法统一为“独取寸口”，简便易行。确立了以手腕寸、关、尺为三部，再分别每部之浮、中、沉为九候的“三部九候”脉诊法。《难经》在论述正常脉及各类疾病所反映出的病脉在疾病诊断上的意义，各类脉象之鉴别等方面，均发挥了《黄帝内经》的理论，使学者更易于理解。

　　23～29难论述了经脉的流注始终、经络的长度、营卫度数、奇经八脉、十五络脉及其有关病证。对《灵枢·经脉篇》作了深入阐述，主言经脉气绝之证候。《难经》集中发挥了《内经》对奇经八脉的含义、内容、循行部位和起止处，以及与十二经脉的关系、发病证侯等。

　　30～47难以脏腑学说为主要议题，介绍了脏腑的解剖形态、生理功能、营卫周行。对三焦、命门、七冲门（即唇为飞门、齿为户门、会厌为吸门、胃为贲门、胃下口为幽门、大肠小肠会为阑门，下极为肛门）、八会理论，皆有阐释。《难经》关于人体消化道由唇到肛门的“七冲门”之论如此精彩，可以说是得益于当时医家在实际解剖所获得的科学数据。

　　48～61难主要论述疾病。强调要以四诊八纲为基础辨证，以五行生克关系来阐明疾病的传变、预后。列举伤寒、泄泻、癫狂、心痛、积聚等，作为辨证的范例，并有不少科学的论断。

　　62～68难主要论述针灸腧穴。重点对五脏的募穴、俞穴的治疗以及五俞穴主治病证深入论述。重视狭义俞穴和一些特定位与经气运行的关系，以及与脏腑的关系等。

　　69～81难主要论针法，如迎随补泻法、刺井泻荥法、补母泻子法、泻火补水法等，以及这些方法的应用、宜忌、注意事项。指出针刺疗法要因时制宜，要着眼于治未病。

　　《难经》不但在理论方面丰富了祖国医药学的内容，而且在临床方面颇多论述。除针灸之外，还提出了“伤寒有五”的理论，对后世伤寒学说与温病学说的发展产生了一定的影响。《难经》对诊断学、针灸学的论述也一直被医家所遵循。对历代医学家理论思维和医理研究有着广泛而深远的影响。